双价抗真菌基因表达载体的构建及转基因西瓜的研究

构建了同时含有番茄儿丁质酶基因（Chi3）和β-1,3-葡聚糖酶基因（Glu-Ac）的双价抗真菌基因植物表达载体,以西瓜（Citrullus lanatus）子叶块为外植体,采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法,将Chi3和Glu-Ac同时导入西瓜栽培种“中育一号”,共获得46株抗性再生植株。经PCR、Southern blot和RT—PCR检测,表明外源基因己成功整合到西瓜基因组中,并在转录水平得到表达。利用尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum）对转基因植株进行离体叶片抗病性检测,表明转基因植株对枯萎病的抗性均有不同程度的增强。     

肿瘤抑素抗肿瘤相关肽的克隆及生物活性

为得到肿瘤抑素中具有直接抗肿瘤活性肽并检测其生物学活性,人工合成肿瘤抑素中185～2 0 3位氨基酸(19肽)所对应的核苷酸序列,将其连接到融合蛋白表达载体pTYB2中,酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL 2 1(DE3)中诱导表达.表达的融合蛋白经几丁质亲和层析、二硫苏糖醇(DTT)的柱内还原,直接获得可溶性19肽.利用MTT法,细胞生长曲线,小鼠H2 2腹水型转移型肝癌实体瘤模型抑瘤实验并结合组织病理学切片,研究19肽的生物学活性.获得的19肽对B16小鼠黑色素瘤细胞、人SMMC 772 1肝癌细胞、人脐静脉内皮细胞的生长均具有抑制作用.小鼠H2 2腹水型肝癌抑瘤率达4 8 4 6 % .病理学切片显示,19肽可促使小鼠肿瘤组织坏死,血管数量减少.19肽具有较强的直接抗肿瘤活性,有可能成为肿瘤治疗的一种新的有前景的药物.     

双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法

组织(或细胞)的蛋白质提取效率直接影响蛋白质双向凝胶电泳(2-DE)的分辨率.为探索建立适用于人乳腺癌细胞株MCF-7蛋白质提取的最佳条件,比较目前在双向凝胶电泳中常用的3种蛋白质提取方法对MCF-7细胞总蛋白的提取效率.MCF-7细胞经培养后,分别采用M-PER试剂、标准裂解液或含硫脲裂解液提取其总蛋白质,然后进行双向凝胶电泳,并根据凝胶上蛋白质斑点的丰度和分布特点判断所得双向电泳图谱的质量,以确定MCF-7细胞蛋白质提取的相对最佳方法.结果显示,M-PER试剂法得到的图谱分辨率较低,蛋白质主要集中分布在分子量15~70kD,pH4.7~6.3的范围内;标准裂解液法得到的图谱分辨率有所提高,蛋白质分布比M-PER试剂法得到的图谱广;硫脲裂解液法得到的图谱是三者中分辨率最高的,尤其是高丰度蛋白和高分子量蛋白分离效果比前两者好.结果表明,在3种常用的蛋白质提取方法中,硫脲裂解液对细胞蛋白质的溶解性最佳,相对更适合于提取MCF-7细胞的蛋白质,并与双向凝胶电泳条件更兼容.     

快速发展的亚细胞蛋白质组学

亚细胞蛋白质组是蛋白质组学领域中的一支新生力量 ,已成为蛋白质组学新的主流方向 ,通过多种策略和技术方法 ,一些重要的亚细胞结构的蛋白质组不断的得到分析 ,到目前为止 ,几乎所有亚细胞结构的蛋白质组学研究都有报道 ,而且已经深入到亚细胞器和复合体水平 ;另外 ,不仅局限于对亚细胞结构的蛋白组成进行简单分析 ,而且更注重功能性分析 ,将定量技术和差异分析引入亚细胞蛋白质组学 ,来观察此亚细胞结构的蛋白质组在某些生理或病理条件下的变化 ,这已经成为亚细胞蛋白质组学新的发展方向 .亚细胞蛋白质组学最大的困难在于怎样确认鉴定出来蛋白质的定位 ,是在提取过程中的污染还是真正在此亚细胞结构中有定位 ?这将是亚细胞蛋白质组学需要努力解决的挑战 .文章全面介绍了亚细胞蛋白质组学的最新研究进展 ,阐述了亚细胞蛋白质组学面临的挑战 ,并对亚细胞蛋白质组学的发展方向作了展望 .     

介质表面修饰对蛋白质芯片固定率和反应性的影响

评价最常用的二种玻璃表面修饰方法对蛋白质芯片质量的影响．选择蛋白质的固定效率、反应性作为检测指标,对戊二醛修饰法和多聚赖氨酸修饰法进行比较,由机械手将探针蛋白质分别固定在两种玻片上,靶蛋白用荧光染料Cy3标记,两种修饰方法的芯片均可使蛋白质保持较好的固定效率和反应活性．由共价键偶联的醛基修饰玻片制备的蛋白质芯片不仅有更高的反应活性,而且图象佳,但背景偏高、用醛基修饰的玻片制备蛋白质芯片是较理想的选择、     

IL-1023-57-PE40可溶表达、纯化及其细胞活性

以IL-10的功能短肽(35肽,即IL10第23至57氨基酸残基)为导向部分与PE40(绿脓杆菌外毒素除去受体结合区后的剩余部分)融合分别置入pet20b( )和pet28a( )构建重组毒素IL102357PE40的两种表达质粒,其中置于pet20b( )的重组毒素在BL21(DE3)pLysS中以周质分泌可溶形式表达,置于pet28a( )的重组毒素在Rosettablue(DE3)中以高效胞质可溶形式表达;依次通过硫酸铵盐析、疏水层析、阴离子交换层析、铜离子亲和层析纯化周质分泌成份,得90%重组毒素纯品;细胞活性实验表明,该重组毒素只对单核巨噬细胞有杀伤作用;细胞ELISA显示,该重组毒素对单核巨噬细胞的杀伤作用(IC50为13.9pmolL)符合绿脓杆菌外毒素的作用机理.     

重组人胰高血糖素样肽-1突变体的分离纯化及活性分析

对基因工程构建的含人胰高血糖素样肽1(hGLP1)突变体的工程菌株进行诱导表达,分离纯化N末端第二位突变的2GlyhGLP1突变体.IPTG诱导4h,收获的菌体经超声破碎后,裂解液用GlutathioneSepharose4B亲和层析纯化GST2GlyhGLP1融合蛋白,经CNBr裂解、SephadexG25柱脱盐、QAESepharoseFF阴离子交换柱层析和RPC18柱脱盐,得到纯度大于98%的重组2GlyhGLP1.Western印迹分析证实,该突变体可被特异性hGLP1抗体所识别.生物学活性分析表明,2GlyhGLP1具有明显的降血糖活性和促胰岛素分泌活性(P<0.001).     

蛋白质组学研究中的一种新方法——配体垂钓

基于表面等离子共振技术的配体垂钓技术能在蛋白质组水平上研究蛋白质的相互作用与功能,提供控制细胞功能的新靶标．其通过将受体固定在芯片表面,当被检测样品流过芯片表面时,配体与受体相结合, 实现俘获未知的相互作用的伙伴蛋白或复合体,并结合质谱技术鉴定出未知蛋白及其序列．     

重组Rhodobacter sphaeroides hemA表达的调控

RhodobactersphaeroideshemA编码5氨基乙酰丙酸合酶(ALAS),催化磷酸吡哆醛依赖性琥珀酰CoA和甘氨酸缩合成ALA.将R.spaeroideshemA导入E.coli进行表达,当hemA具有与lac启动子相同的转录方向时,ALAS有活性.lac启动子与hemA之间的距离会影响ALAS在不同培养基上的表达.E.coli宿主菌对ALAS表达、ALA产量有显著影响,在实验所用6种菌株中,E.coliDH1是最佳宿主菌(P<0.05).ALAS表达还与碳源有关,琥珀酸为碳源时,重组ALAS活性最高(P<0.05),以乳酸为碳源时,ALAS活性很低.重组ALAS活性也受培养基pH值影响,pH6.5时,活性最高(P<0.05).     

静脉注射41BBLGFP融合表达质粒体内表达及其生物学活性

通过RTPCR方法扩增小鼠41BBLcDNA,以pEGFPN1为载体,构建融合蛋白41BBLGFP重组表达质粒p41BBLGFP.采用基于流体力学原理建立的裸DNA体内转染技术,从小鼠尾静脉快速(15s)注射质粒p41BBLGFP进行体内转染.荧光显微镜观察组织切片,见小鼠肝、脾、肾及肺中均有报告基因GFP表达,尤以肝细胞中荧光最强.进一步用Western印迹和免疫组织化学染色法确定肝细胞表面表达41BBL,用Hsp70H22细胞抗原肽皮下免疫小鼠,同时尾静脉注射质粒p41BBLGFP,检测血清中IL2和IFNγ的分泌.结果显示,质粒注射联合免疫组小鼠血清IL2和IFNγ的浓度分别较生理盐水对照组增加了3倍和4倍;脾细胞对H22细胞的杀伤率则由单独免疫组的45.74%±3.27%增至86.74%±9.36%.结果表明,体内(主要在肝脏)转染质粒p41BBLGFP可以成功表达,表达产物具有41BBL的生物学活性,为进一步研究体内转染41BBL用于基因治疗奠定了基础.